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論文
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The sp7 gene is required for maturation of osteoblast-lineage cells in medaka (Oryzias latipes) vertebral column development 査読
Yuki Azetsu, Keiji Inohaya, Yoshiro Takano, Masato Kinoshita, Mai Tasaki, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL BIOLOGY 431 ( 2 ) 252 - 262 2017年11月
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TGFβ-2 signaling is essential for osteoblast migration and differentiation during fracture healing in medaka fish. 査読
Takeyama K, Chatani M, Inohaya K, Kudo A
Bone 86 68 - 78 2016年5月
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Reiterative expression of pax1 directs pharyngeal pouch segmentation in medaka 査読
Kazunori Okada, Keiji Inohaya, Takeshi Mise, Akira Kudo, Shinji Takada, Hiroshi Wada
DEVELOPMENT 143 ( 10 ) 1800 - 1810 2016年5月
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Osteoblast and osteoclast behaviors in the turnover of attachment bones during medaka tooth replacement 査読
Akiko Mantoku, Masahiro Chatani, Kazushi Aono, Keiji Inohaya, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL BIOLOGY 409 ( 2 ) 370 - 381 2016年1月
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The Parapineal Is Incorprorated into the Habenula during Ontogenesis in the Medaka Fish 査読
Yuji Ishikawa, Keiji Inohaya, Naoyuki Yamamoto, Kouichi Maruyama, Masami Yoshimoto, Masayuki Iigo, Tadashi Oishi, Akira Kudo, Hironobu Ito
BRAIN BEHAVIOR AND EVOLUTION 85 ( 4 ) 257 - 270 2015年
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Differential Reparative Phenotypes Between Zebrafish and Medaka After Cardiac Injury 査読
Kohei Ito, Mai Morioka, Shun Kimura, Mai Tasaki, Keiji Inohaya, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 243 ( 9 ) 1106 - 1115 2014年9月
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Eda/Edar signaling guides fin ray formation with preceding osteoblast differentiation, as revealed by analyses of the medaka all-fin less mutant afl 査読
Yuuki Iida, Kenta Hibiya, Keiji Inohaya, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 243 ( 6 ) 765 - 777 2014年6月
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Bmp7 and Lef1 Are the Downstream Effectors of Androgen Signaling in Androgen-Induced Sex Characteristics Development in Medaka 査読
Yukiko Ogino, Ikumi Hirakawa, Keiji Inohaya, Eri Sumiya, Shinichi Miyagawa, Nancy Denslow, Gen Yamada, Norihisa Tatarazako, Taisen Iguchi
ENDOCRINOLOGY 155 ( 2 ) 449 - 462 2014年2月
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Design, evaluation, and screening methods for efficient targeted mutagenesis with transcription activator-like effector nucleases in medaka 査読
Ansai, Satoshi, Inohaya, Keiji, Yoshiura, Yasutoshi, Schartl, Manfred, Uemura, Norihito, Takahashi, Ryosuke, Kinoshita, Masato
DEVELOPMENT GROWTH & DIFFERENTIATION 56 ( 1 ) 98 - 107 2014年1月
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Trunk exoskeleton in teleosts is mesodermal in origin 査読
Atsuko Shimada, Toru Kawanishi, Takuya Kaneko, Hiroki Yoshihara, Tohru Yano, Keiji Inohaya, Masato Kinoshita, Yasuhiro Kamei, Koji Tamura, Hiroyuki Takeda
NATURE COMMUNICATIONS 4 1639 2013年3月
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Bef medaka mutant reveals the essential role of c-myb in both primitive and definitive hematopoiesis 査読
Akemi Moriyama, Keiji Inohaya, Kouichi Maruyama, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL BIOLOGY 345 ( 2 ) 133 - 143 2010年9月
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Production of Wnt4b by floor plate cells is essential for the segmental patterning of the vertebral column in medaka 査読
Keiji Inohaya, Yoshiro Takano, Akira Kudo
DEVELOPMENT 137 ( 11 ) 1807 - 1813 2010年6月
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sec24d encoding a component of COPII is essential for vertebra formation, revealed by the analysis of the medaka mutant, vbi 査読
Satoshi Ohisa, Keiji Inohaya, Yoshiro Takano, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL BIOLOGY 342 ( 1 ) 85 - 95 2010年6月
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Scale and tooth phenotypes in medaka with a mutated ectodysplasin-A receptor: implications for the evolutionary origin of oral and pharyngeal teeth 査読
A. D. S. Atukorala, Keiji Inohaya, Otto Baba, Makoto J. Tabata, R. A. R. K. Ratnayake, Dawud Abduweli, Shohei Kasugai, Hiroshi Mitani, Yoshiro Takano
ARCHIVES OF HISTOLOGY AND CYTOLOGY 73 ( 3 ) 139 - 148 2010年
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Purification and characterization of zebrafish hatching enzyme - an evolutionary aspect of the mechanism of egg envelope digestion 査読
Kaori Sano, Keiji Inohaya, Mari Kawaguchi, Norio Yoshizaki, Ichiro Iuchi, Shigeki Yasumasu
FEBS JOURNAL 275 ( 23 ) 5934 - 5946 2008年12月
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Phenotypic Analyses of a Medaka Mutant Reveal the Importance of Bilaterally Synchronized Expression of Isthmic fgf8 for Bilaterally Symmetric Formation of the Optic Tectum 査読
Shigeo Takashima, Takahiro Kage, Takako Yasuda, Keiji Inohaya, Kouichi Maruyama, Kazuo Araki, Hiroyuki Takeda, Yuji Ishikawa
GENESIS 46 ( 10 ) 537 - 545 2008年10月
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Function of Pax1 and Pax9 in the sclerotome of medaka fish 査読
Takeshi Mise, Minoru Iijima, Keiji Inohaya, Akira Kudo, Hiroshi Wada
GENESIS 46 ( 4 ) 185 - 192 2008年4月
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The medaka FoxP2, a homologue of human language gene FOXP2, has a diverged structure and function 査読
Tatsuo Itakura, Abhishek Chandra, Zhi Yang, XiaoDong Xue, Bo Wang, Wataru Kimura, Keisuke Hikosaka, Keiji Inohaya, Akira Kudo, Tadayoshi Uezato, Naoyuki Miura
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 143 ( 3 ) 407 - 416 2008年3月
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Expression of marker genes during otolith development in medaka 査読
Yoshiyuki Nemoto, Masahiro Chatani, Keiji Inohaya, Yuji Hiraki, Akira Kudo
GENE EXPRESSION PATTERNS 8 ( 2 ) 92 - 95 2008年1月
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The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: In vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish 査読
Keiji Inohaya, Yoshiro Takano, Akira Kudo
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 236 ( 11 ) 3031 - 3046 2007年11月
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Medaka unextended-fin mutants suggest a role for Hoxb8a in cell migration and osteoblast differentiation during appendage formation 査読
S Sakaguchi, Y Nakatani, N Takamatsu, H Hori, A Kawakami, K Inohaya, A Kudo
DEVELOPMENTAL BIOLOGY 293 ( 2 ) 426 - 438 2006年5月
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Morphogenesis and regionalization of the medaka embryonic brain 査読
T Kage, H Takeda, T Yasuda, K Maruyama, N Yamamoto, M Yoshimoto, K Araki, K Inohaya, H Okamoto, S Yasumasu, K Watanabe, H Ito, Y Ishikawa
JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY 476 ( 3 ) 219 - 239 2004年8月
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Large-scale analysis of the genes involved in fin regeneration and blastema formation in the medaka, Oryzias latipes 査読
R Katogi, Y Nakatani, T Shin-i, Y Kohara, K Inohaya, A Kudo
MECHANISMS OF DEVELOPMENT 121 ( 7-8 ) 861 - 872 2004年7月
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Twist functions in vertebral column formation in medaka, Oryzias latipes 査読
J Yasutake, K Inohaya, A Kudo
MECHANISMS OF DEVELOPMENT 121 ( 7-8 ) 883 - 894 2004年7月
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A mutation in the gene for delta-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) causes hypochromic anemia in the medaka, Oryzias latipes 査読
D Sakamoto, H Kudo, K Inohaya, H Yokoi, T Narita, K Naruse, H Mitani, K Araki, A Shima, Y Ishikawa, Y Imai, A Kudo
MECHANISMS OF DEVELOPMENT 121 ( 7-8 ) 747 - 752 2004年7月
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The novel medaka transglutaminase gene is expressed in developing yolk veins 査読
D Koh, K Inohaya, Y Imai, A Kudo
GENE EXPRESSION PATTERNS 4 ( 3 ) 263 - 266 2004年5月
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Zebrafish periostin is required for the adhesion of muscle fiber bundles to the myoseptum and for the differentiation of muscle fibers 査読
H Kudo, N Amizuka, K Araki, K Inohaya, A Kudo
DEVELOPMENTAL BIOLOGY 267 ( 2 ) 473 - 487 2004年3月
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Erratum: Expression of zisp, a DHHC zinc finger gene, in somites and lens during zebrafish embryogenesis (Gene Expression Patterns (2002) vol. 2 (355-358)) 査読
Masato Nagaya, Keiji Inohaya, Yoshiyuki Imai, Akira Kudo
Gene Expression Patterns 3 ( 4 ) 546 2003年8月
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Expression of zisp, a DHHC zinc finger gene, in somites and lens during zebrafish embryogenesis 査読
Masato Nagaya, Keiji Inohaya, Yoshiyuki Imai, Akira Kudo
Gene Expression Patterns 2 ( 3-4 ) 355 - 358 2002年12月
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Expression of zisp, a DHHC zinc finger gene, in somites and lens during zebrafish embryogenesis 査読
Masato Nagaya, Keiji Inohaya, Yoshiyuki Imai, Akira Kudo
MECHANISMS OF DEVELOPMENT 119 S311 - S314 2002年12月
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pc1 and psc1, zebrafish homologs of Drosophila Polycomb and Posterior sex combs, encode nuclear proteins capable of complex interactions 査読
A Kawamura, S Yokota, K Yamada, H Inoue, K Inohaya, K Yamazaki, Yasumasu, I, T Higashinakagawa
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 294 ( 2 ) 456 - 463 2002年6月
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Temporal and spatial patterns of cbfal expression during embryonic development in the teleost, Oryzias latipes 査読
K Inohaya, A Kudo
DEVELOPMENT GENES AND EVOLUTION 210 ( 11 ) 570 - 574 2000年11月
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Analysis of the origin and development of hatching gland cells by transplantation of the embryonic shield in the fish, Oryzias latipes
Inohaya Keiji, Yasumasu Shigeki, Yasumasu Ikuo, IUCHI Ichiro, YAMAGAMI Kenjiro
Development, growth & differentiation 41 ( 5 ) 557 - 566 1999年10月
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Species-dependent migration of fish hatching gland cells that commonly express astacin-like proteases in common
Inohaya Keiji, Yasumasu Shigeki, Araki Kazuo, NARUSE Kiyoshi, YAMAZAKI Ken, YASUMASU Ikuo, IUCHI Ichiro, YAMAGAMI Kenjiro
Development, growth & differentiation 39 ( 2 ) 191 - 197 1997年4月
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Different exon intron organizations of the genes for two astacin-like proteases, high choriolytic enzyme (choriolysin H) and low choriolytic enzyme (choriolysin L), the constituents of the fish hatching enzyme 査読
S Yasumasu, H Shimada, K Inohaya, K Yamazaki, Iuchi, I, Yasumasu, I, K Yamagami
EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 237 ( 3 ) 752 - 758 1996年5月
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Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression for the Hatching Enzyme in the Teleost Embryo, Oryzias latipes
Keiji Inohaya, Shigeki Yasumasu, Mika Ishimaru, Akihiro Ohyama, Ichiro Iuchi, Kenjiro Yamagami
Dev Biol 171 ( 2 ) 374 - 385 1995年10月
MISC
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Rearing Medaka Fish in International Space Station (ISS) for Bone Metabolism Study.
Masahiro Chatani, Akiko Mantoku, Kazuhiro Takeyama, Kazuhiro Aoki, Yasutaka Sugamori, Keiichi Ohya, Satoko Uchida, Hiromi Suzuki, Toru Sakimura, Yasushi Kono, Fumiaki Tanigaki, Masaki Shirakawa, Keiji Inohaya, Dawud Abduweri, Yoshiro Takano, Akira Kudo
JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH 29 S398 - S398 2014年2月
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Evolution of Pax1 and Pax9 roles mediated by evolution of cis regulatory elements in teleost
Takeshi Mise, Minoru Iizima, Keiji Inohaya, Akira Kudo, Hiroshi Wada
ZOOLOGICAL SCIENCE 22 ( 12 ) 1460 - 1460 2005年12月
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Heritable malformations induced by X-irradiation and ENU in the medaka :
YASUDA Takako, YOKOI Hayato, INOHAYA Keiji, SAKAMOTO Daigo, ICHIKAWA Kumi, OTA Munehiro, NARITA Takanori, AOKI Kazuko, SASANUMA Motoe, MATSUMOTO Atsuko, ISHIKAWA Yuji
Journal of radiation research 42 ( 4 ) 518 - 518 2001年
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Medaka as a model organism of skeletal development
K. Inohaya, A. Kudo
Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, nucleic acid, enzyme 45 ( 17 ) 2745 - 2751 2000年
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Species-dependent migration of fish hatching gland cells that express astacin-like proteases in common (vol 39, pg 191, 1997)
K Inohaya, S Yasumasu, K Araki, K Naruse, K Yamazaki, Yasumasu, I, Iuchi, I, K Yamagami
DEVELOPMENT GROWTH & DIFFERENTIATION 39 ( 3 ) 404 - 404 1997年6月
共同研究・競争的資金等の研究課題
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硬節細胞が血管新生を制御する新たなメカニズムの解明
研究課題/領域番号：25K09685 2025年4月 - 2028年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
猪早 敬二
配分額：4550000円 （ 直接経費：3500000円 、 間接経費：1050000円 ）
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メダカ椎間における硬節細胞の多分化能の検証とWntによる未分化性維持機構の解析
研究課題/領域番号：21K06245 2021年4月 - 2024年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
猪早 敬二
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
メダカ脊椎の椎間領域(椎間板に相当する組織)は骨成長の場であると共に、硬節に由来する骨芽細胞の前駆細胞が未分化の状態で維持されていると考えられる。これらの硬節由来細胞の未分化性の維持には、Wntファミリーに属する遺伝子、wnt4bが必須であることがメダカ変異体の解析で分かった。本研究では、硬節由来細胞の分化を制御する分子カスケードを明らかにするとともに、椎間域の硬節由来細胞の多分化能の有無についても精査することを目的としている。初年度ではまず、硬節マーカー遺伝子のプロモーター制御下で、Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックメダカ系統の作製を試みた。CRISPER/Cas9システムを用いたゲノム編集技術により、Cre遺伝子を硬節マーカー遺伝子のプロモーター下流にノックインすることで作製に成功した。これらのCre系統とloxPメダカ（Creが発現した細胞で蛍光タンパク質を発現誘導するトランスジェニック系統）とを交配することで、硬節由来細胞を蛍光標識して追跡観察することが可能となる。そこで次に、骨芽細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーター制御下で普段はDsRed、Cre存在下でEGFPを発現誘導するloxP系統も作製した。これらのCreメダカとloxPメダカとを交配し、硬節細胞が骨芽細胞へと分化するか否かを調べたところ、骨芽細胞の一部がEGFP陽性細胞であることが確認できた。この結果は、作製されたCre-loxPシステムが有効であることと共に、メダカの硬節細胞が骨芽細胞へと分化していることを強く示唆している。
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アンドロゲン応答形質の多様化と適応の分子生物学的基盤
研究課題/領域番号：15K07138 2015年4月 - 2018年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
荻野 由紀子, 山田 限, 渡辺 英治, 猪早 敬二
配分額：5070000円 （ 直接経費：3900000円 、 間接経費：1170000円 ）
アンドロゲンは脊椎動物において、二次性徴を誘導し雄性形質を特徴付けている。本研究では真骨魚類アンドロゲン受容体（AR）遺伝子の進化過程およびAR遺伝子重複の生物学的意義について解析した。その結果、真骨魚類の系統特異的に起きたゲノム倍数化による ARα/ARβへの重複、ARαの新機能の獲得と真骨魚類の多様な雄性形質発現との間に関連性を見出した。ARαは闘争形質、ARβは繁殖に必要な外部形態発現に必須の役割を示すなど、生体内における機能の相違が明らかとなった。ARαは新真骨魚類の系統で高度に保存されており、多様な二次性徴を生み出す一つの重要な原動力（遺伝的背景）となった可能性が考えられた。
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宇宙実験のためのメダカ骨形成分子基盤の解明
研究課題/領域番号：26506005 2014年4月 - 2018年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
猪早 敬二
配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）
ゲノム編集技術を用いて、骨形成に関わる遺伝子のノックアウトメダカを作製した。特に転写因子であるsp7/ostrixの変異体では、頭部、胴尾部や鰭などの全身の骨組織で骨形成不全が見られ、マウスと同様にメダカにおいても、sp7/osterix遺伝子が骨形成に必須の遺伝子であることが分かった。また、10型コラーゲンを発現する細胞が未熟な骨芽細胞であること、さらに、それらの細胞の成熟には、sp7/osterix遺伝子の発現が必須であることが明らかとなった。
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Ｗｎｔシグナルを介したフロアープレートによる脊椎分節機構の解析
研究課題/領域番号：23570251 2011年4月 - 2015年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
猪早 敬二
配分額：5460000円 （ 直接経費：4200000円 、 間接経費：1260000円 ）
fu-2は脊椎骨が融合し、脊椎の分節性が失われる自然発生突然変異体である。fu-2の原因遺伝子を同定するためにポジショナルクローニングを行ったところ、fu-2の原因遺伝子は染色体23番の末端に位置しており、メダカゲノムデータベース上に存在しない未知の領域で在ることが判明した。この未知の領域には、Wntシグナル経路に関与する遺伝子が2種類あることが分かったが、原因遺伝子の同定には至らなかった。
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脊椎の分節性を生み出すロジックの解明
研究課題/領域番号：23127503 2011年4月 - 2013年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
猪早 敬二
配分額：9620000円 （ 直接経費：7400000円 、 間接経費：2220000円 ）
従来、脊椎の分節は胚発生初期の体節の分節性に依存するとされてきたが、体節の分節性に依存しない脊椎分節機構の存在が、最近の報告から示唆されている。すなわち体節から分化した骨芽細胞は、体節の分節性にとらわれることなく、自発的に秩序ある脊椎の分節パターンをつくり出すと考えられる。本研究では、骨芽細胞の動態や、筋肉・神経・血管などの諸器官との相互作用を、トランスジェニックメダカを用いてライブイメージング解析し、それらをもとに脊椎形成の新たなロジックを発見・提唱することを目指している。
当該年度は、ライブイメージング解析を行うためのトランスジェニクメダカ系統の開発を主に行った。その1つである10型コラーゲン-EGFPトランスジェニックメダカは、成熟軟骨細胞の分化マーカーである細胞外マトリックス蛋白質、10型コラーゲンのプロモーター制御下でEGFPが発現するトランスジェニック系統である。興味深いことに、10型コラーゲンは硬骨魚類において骨芽細胞で発現することが知られている。本研究で開発に成功したメダカトランスジェニック系統においても、骨の石灰化パターンにしたがってEGFP陽性細胞が出現することが確認され、これらのEGFP陽性細胞は骨芽細胞であることが強く示唆された。また10型コラーゲン-EGFP陽性細胞が骨芽細胞であることを同定するために、既存のosterix-DsRedトランスジェニック系統とのダブルトランスジェニックメダカを作製した。その結果、10型コラーゲン-EGFP陽性細胞の一部がosterix-DsRed陽性細胞へと変化することが明らかとなり、10型コラーゲン-EGFP陽性細胞は骨芽細胞の前駆細胞であると結論した。本研究の成果により、骨芽細胞前駆細胞から骨芽細胞への分化が生きたままの個体で観察することが可能となった。 -
フロアープレートによるWntシグナルを介した脊椎分節機構の解明
研究課題/領域番号：20570199 2008年 - 2010年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
猪早 敬二
配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）
メダカ突然変異体fused centrum(fsc)の解析から、メダカ脊椎の分節性の獲得・維持には、フロアープレート(底板)でのWntファミリー遺伝子の発現が必須であることを発見した。このことは、従来知られているフロアープレートの役割(神経管の分化、神経軸索の走向性)に加え、新たな機能の存在を証明するものである。
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トランスジェニックメダカを用いた脊椎形成突然変異体のスクリーニングとその解析
研究課題/領域番号：15770142 2003年 - 2004年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B)
猪早 敬二
配分額：3600000円 （ 直接経費：3600000円 ）
申請者らが開発に成功した、twist遺伝子のプロモーターを用いたGFPトランスジェニックメダカ系統では、生きたまま硬節の挙動を観察することが可能である。twist-GFP陽性細胞は胚発生の過程で、予定椎間板領域の脊索周囲に局在するようになり、その局在は成魚の椎間板の周囲においても継続して観察される。透過型電子顕微鏡を用いて超微細構造学的な解析を行ったところ、twist-GFP陽性細胞は立方体もしくは楕円形で、いずれも粗面小胞体に富んでおり、哺乳類における典型的な骨芽細胞の特徴と一致した。これらの結果は、twist-GFP陽性細胞が椎体形成を担う骨芽細胞であり、椎間板領域が椎体形成の場として機能的であることを示唆している。また、脊椎融合の表現型を示す自然発生突然変異体であるダルマメダカとトランスジェニック系統との交配により、twist-GFPトランスジェニック"ダルマ"メダカを作製したところ、椎体同士の融合が認められる予定椎間板領域において、twist-GFPの発現が欠失していることが明らかとなった。この結果は、硬節細胞の椎間板形成への関与を支持するものであり、twist-GFPトランスジェニック系統を用いて、硬節および脊椎に異常を示す突然変異体の単離を行う本実験方法が有効であることを示した。さらに、化学変異剤ENU(N-エチル-N-ニトロソ尿素)を用いて突然変異を誘発し、脊椎形成に関わる突然変異体の単離を行った。その結果、脊椎の分節性が左右でズレが生じる変異体が2系統、脊椎融合を示す変異体を3系統、単離することに成功した。
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メダカヒレ再生関連遺伝子の網羅的スクリーニングとゲノムマッピング
研究課題/領域番号：14011215 2002年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究
工藤 明, 猪早 敬二, 今井 義幸
配分額：6100000円 （ 直接経費：6100000円 ）
これまでに再生芽にfgfr1が発現し、再生芽の形成、維持にFgfシグナルが働くことがゼブラフィッシュで示されているが、再生芽誘導機構やその後の組織再生を司る分子メカニズムは明らかにされていない。そこで、ヒレ再生制御遺伝子群の網羅的単離を目的にEST解析を行った。形態学的観察結果をもとに再生芽形成が盛んな再生3日目、後期の組織再生が盛んな再生10日目ヒレよりcDNAライブラリーを構築し各ステージ10,000クローンのランダムシークエンスを行った。シークエンスの完了した再生10日目EST7,006クローンの配列情報に基づきクラスタリング解析を行った結果、独立した3,461種類の遺伝子が含まれること、さらに5'上流配列に基づくblast解析を行った結果、その約6割が既知遺伝子であることが明らかになった。再生芽が形成され、幹細胞が分化開始する時期であるメダカヒレ再生3日目のcDNAライブリーを構築し、遺伝研において10,000シークエンスが終了した。その結果8,901個のシークエンスが得られ、そのうち3,454種類の遺伝子が含まれ、1個しかシークエンスがなかったものが2,323個あり全体の67.2%を占めた。3,454のうち1,166クラスター(33.8%)のみが10日目のシークエンスと重なっており、再生芽特異的cDNAがかなり含まれていると思われる。3日と10日のESTクローンから新規の遺伝子を中心に3,000個を選びDNAマイクロアレイを作成した。このDNAチップを用い、ヒレ再生1日目、3日目、10日目通常ヒレのRNAをハイブリダイズし、解析した結果ヒレ再生1日目に特異的なクローン26個を得た。
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メダカヒレ再生関連遺伝子の網羅的スクリーニングとゲノムマッピング
研究課題/領域番号：13202020 2001年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(C)
工藤 明, 猪早 敬二
配分額：6000000円 （ 直接経費：6000000円 ）
1.ESTクローンとその解析 再生芽が形成され、幹細胞が分化開始する時期であるメダカヒレ再生3日目のcDNAライブリーを構築し、遺伝研において10000シークエンスが終了した。その結果8901個のシークエンスが得られ、そのうち3454種類の遺伝子が含まれ、1個しかシークエンスがなかったものが2323個あり全体の67.2%を占めた。
最も再生が盛んな切断後10日目のESTシークエンスとRNA in-situによる発現解析の結果、クローン13c18はヒレ切断2日目より発現を開始し、再生芽に特異的発現を示すことが明らかになった。さらに再生の進行に伴い伸張ヒレの先端の未分化な再生芽領域に継続的に発現を示すものの、未切断ヒレには発現は見られない。またこの発現パターンは再生芽形成に関与すると考えられるfgfr1に一致し、13c18は再生の開始に重要な機能を持っている。
2.メダカ遺伝子のゲノムマッピング (1)胸びれを欠くpl (pectoral fin-less)変異体と、赤血球の形成に欠損を示すwho (white out)変異体について、マッピングを行った。plはLG10に位置することがわかり、0.2cM以内の場所に3種類のDNAマーカーを同定した。whoはLG12にマップされ、0.5cM以内に位置するDNAマーカーを1つ同定した。plとwhoの原因遺伝子を同定するために、それぞれのDNAマーカーをもつBACクローンを単離して、染色体歩行を開始した。また心臓形成に異常を示すrbiやbhtについてもマッピングを試みている。
(2)血管で発現するfli、心臓で発現するtbx5、骨形成に関与するbmp1などの37個の遺伝子について、染色体地図上にマッピングを行った。現在解析中の突然変異の近傍にマッピングされた遺伝子はなく、原因遺伝子の候補は得られていない。引き続きESTのマッピングを進めている。 -
メダカヒレ再生関連遺伝子の網羅的スクリーニング
研究課題/領域番号：12202018 2000年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(C)
工藤 明, 猪早 敬二
硬骨魚類であるゼブラフィッシュやメダカは幼生期まで透明で、顕微鏡下で発生/再生の様子を観察することが可能であり、再生モデルとして非常に優れている。特にメダカはゼブラフィッシュと比較してゲノムサイズが小さく特定の遺伝子のクローニングに有利であるばかりでなく、種々変異体を作りやすく、将来その変異と原因遺伝子の対応が可能となる。ゼブラフィッシュやメダカのヒレは切断後、約2週間で元に戻り、再生研究の材料として特に優れているにも関わらず、これまでゼブラフィッシュやメダカのみならず魚のヒレを使った再生研究はほとんどなされていない。ヒレの再生には骨、血管、神経などの各組織の形成も惹起され、その再生過程は発生過程の繰り返しである。我々は試みにヒレ切断後2日目の再生芽が構築された直後のcDNAと、7日目のヒレ再生が盛んな時のcDNAを単離し、それぞれ150個あまりDNAシークエンスを行った。その結果、発現している遺伝子群は再生時期で非常に異なり、その発現遺伝子がヒレ再生の各段階における組織特異性を示していると考えられる。従って各ヒレ再生段階に発現している連伝子群の網羅的スクリーニングを行うことにより、どのように組織形成されるかその全体像を捕まえることが可能になると共に、組織形成特異的遺伝子のクローニングが可能になる。実際にヒレ再生特異的に発現している遺伝子が再生のメカニズムに関与しているかどうかゼブラフィッシュを用いfeasible studyを試みた。
骨、血管、神経等の再生が盛んなヒレ切断後7日目に特異的に発現している導伝子をdifferential screeningし、新しいトランスグルタミナーゼ遺伝子を得た。この遺伝子は心臓原基、血管に特異的発現を示した。アンチセンスによる発現ブロックを試みたところ、心臓形態異常が観察され、心臓血管系の形成に機能する遺伝子であることが示唆された。次に同様の方法で再生に係わる幹細胞集団が存在する再生芽を形成する時期(すなわちヒレ切断後2日目)に特異的に発現する新規遺伝子のスクリーニングに成功した。この遺伝子は胚発生時においても体節特異的に発現する遺伝子であり、過剰発現により体節形成に異常が生ずることが、体節の形成に重要な機能をする遺伝子であることが明らかになった。 -
骨転移癌、骨肉腫に共通して発現するカドヘリン-11/OBカドヘリン異性体の機能
研究課題/領域番号：12213045 2000年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(C)
工藤 明, 猪早 敬二, 竹下 淳
配分額：3500000円 （ 直接経費：3500000円 ）
我々は、細胞間接着分子カドヘリンに骨芽細胞分化制御機能があることを報告する。各種間葉系細胞株におけるカドヘリンの発現を調べた結果、各細胞株はそれぞれが独特なカドヘリンの発現様式を持っており、骨芽細胞系譜では、OBカドヘリン(カドヘリン-11)およびNカドヘリンを発現していることがわかった。同一細胞において複数種のカドヘリンが発現することの意味を調べるために、頭頂骨骨芽細胞と同程度にOBおよびNカドヘリンを発現させたL細胞(L-OB/N)ならびに、それぞれ単独で発現させたL細胞(L-OB,L-N,L-MOCK)を作製した。細胞染色の結果、OBとNカドヘリンは、それぞれが独立してアドヘレンスジャンクションに局在し、共に細胞接着に寄与していると考えられた。また、L-OB/Nにおいては骨芽細胞分化マーカーであるALP,Osteocalcinの発現誘導および骨芽細胞分化のマスター遺伝子であるCbfalの発現上昇が確認された。L-OBでは微弱ながらALPの発現が確認でき、L-N,L-MOCKでは全くそれら発現は確認されなかった。以上のことよりOBカドヘリンは骨芽細胞分化を方向付けし、Nカドヘリンはその作用を増強すると考えられた。NIH3T3においても同様の実験を試みたところALP,Osteocalcinの発現誘導は確認出来なかったが、FGFR2の発現が上昇し、L-OB/Nにおいても同様に発現上昇が確認された。FGFR2は、突然変異が骨格系に多くの異常を示し、Osteopontin発現上昇以前の骨芽細胞前駆細胞において発現することから、骨芽細胞初期分化に重要であると考えられている。これらのことより、OBとNカドヘリンは、未分化な骨芽細胞前駆細胞の細胞分化運命を決定していると考えられる。今回の結果は、複雑な細胞間相互作用が複数種のカドヘリンのよる細胞間認識の結果であると共に、細胞間認識による細胞分化決定機構の存在を示唆するものである。
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人工骨髄の構築による新しいB細胞分化系の確立
研究課題/領域番号：11877058 1999年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽的研究
工藤 明, 猪早 敬二, 竹下 淳
配分額：2000000円 （ 直接経費：2000000円 ）
B細胞は骨髄の微細環境下で骨髄幹細胞から分化する。in-vitroのB細胞培養系において、ストローマ細胞は骨髄微細環境のかわりができ、インターロイキン7(IL7)の存在下でプレB細胞の増殖をサポートする。我々はこのin-vitroの培養系においてプレート上のストローマ細胞は骨髄微細環境を代替するには不十分であると考え、ストローマ細胞から骨への細胞分化を誘導できるハイドロキシアパタイト(HA)を培養系に応用した。HAをストローマ細胞でおおった後、その上で骨髄細胞と脾臓細胞をIL-7の存在下で培養した。7日後、新しいプレB細胞のポピュレーションが現れた。
それは1)B220low、BP^+CD43^+及び代替L鎖(VpreB,【lambda bar】5)陽性のプレB細胞が得られたこと。
2)7週令のマウスの脾臓由来のプレB細胞が得られたことは、成体マウスの脾臓から得られたプレB細胞としてその特徴を明らかにできた初めての実験例である。すべての確立したプレB細胞は未熟B細胞(IgM^+)へ分化できた。
我々はHAの構造がIL7応答性の未安定なプレB細胞を安定化させることにより新しいポピュレーションが得られたと考えている。